技術文章您現在的位置:首頁 > 技術文章 > 石蠟切片基本技術
石蠟切片基本技術
發布時間:2022-03-28   點擊次數:78次
   石蠟切片(paraffin section) 組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構,也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法,而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。教學中,光鏡下觀察切片標本多數是石蠟切片法制備的?;畹募毎蚪M織多為無色透明,各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差,在一般光鏡下不易清楚區別出;組織離開機體后很快就會死亡和產生組織fu敗,失去原有正常結構,因此,組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡,而能清晰辨認其形態結構。
  基本技術
  石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標本需要數日,但標本可以長期保存使用,為永f久性顯微玻片標本。
  取材
  應根據要求選取材料來源及部位。例如植物細胞有絲分裂多選取洋蔥根尖,細胞分裂快又便于切??;豬的肝小葉邊界清晰明確;耳蝸以豚鼠的內耳易于定位和剝離。材料必須新鮮,擱置時間過久則產生蛋白質分解變性,導致細胞自溶及細菌的滋生,而不能反映組織活體時的形態結構。
  固定
  用適當的化學藥液——固定液浸漬切成小塊的新鮮材料,迅速凝固或沉淀細胞和組織中的物質成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化,盡可能保持其活體時的結構。固定能使組織硬化,有利于切片的進行,而且也有媒浸作用,有利于組織著色。固定液的種類很多,其對組織的硬化收縮程度以及組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪,甲醛能固定一般組織,但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛(乙醛、福爾馬林)、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸(四氧化鋨)、重鉻酸鉀及苦味酸等,單一固定液不能固定細胞中的所有成分;混合固定液可以互補不足,常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液(配方見有關技術書籍)。因此,應根據所要顯示的內容來選擇適宜的固定液。10%福爾馬林(4%甲醛)或10%磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規使用的固定液,不僅適用于常規蘇木精-伊紅(HE)染色,還可以用于組織學有關的其他技術的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右,固定時間則根據材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定,可以從1小時至數天,通常為1小時至24小時。
  洗滌與脫水
  固定后的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉淀,否則會影響后期的染色效果。該步驟稱作洗滌多數用流水沖洗;使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗;使用酒精或酒精混合液固定的組織,則不必洗滌,可直接進行脫水。固定后或洗滌后的組織內充滿水分,若不除去水分則無法進行以后的透明、浸蠟與包埋處理,原因在于透明劑多數是苯類,苯類和石蠟均不能與水相溶合,水分不能脫盡,苯類無法浸入。酒精為常用脫水劑,它既能與水相混合,又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮,應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行,通常從30%或50%酒精開始,經70%、85%、95%直至純酒精(無水乙醇),每次時間為1~數小時,如不能及時進行各級脫水,材料可以放在70%酒精中保存,因高濃度酒精易使組織收縮硬化,不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環等也可做脫水劑。
  透明
  純酒精不能與石蠟相溶,還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液,替換出組織內的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬,出現透明狀態,此液即稱透明劑,透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1~2小時,再轉入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時間則要根據組織材料塊大小及屬于囊腔抑或實質器官而定。如果透明時間過短,則透明不徹底,石蠟難于浸入組織;透明時間過長,則組織硬化變脆,就不易切出完整切片,最長為數小時。
  浸蠟與包埋
  用石蠟取代透明劑,使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1~2小時,再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右,浸蠟應在高于石蠟熔點3℃左右的溫箱中進行,以利石蠟浸入組織內。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中(擺好在蠟中的位置),待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻,即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數量多,應進行編號,以免差錯。石蠟熔化后應在蠟箱內過濾后使用,以免因含雜質而影響切片質量,且可能損傷切片刀。通常石蠟采用熔點為56~58℃或60~62℃兩種,可根據季節及操作環境溫度來選用。
  切片
  包埋好的蠟塊用刀片修成規整的四棱臺,以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上,夾在輪轉式切片機的蠟塊鉗內,使蠟塊切面與切片刀刃平行,旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質量,可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4~7微米,切出一片接一片的蠟帶,用毛筆輕托輕放在紙上。
  貼片與烤片
  用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上,以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油,再將一定長度蠟帶(連續切片)或用刀片斷開成單個蠟片于溫水(45℃左右)中展平后,撈至玻片上鋪正,或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上,再把蠟片放于水滴上,略加溫使蠟片鋪展,最后用濾紙吸除多余水分,將載玻片放入45℃溫箱中干燥,也可在37℃溫箱中干燥,但需適當延長時間。
  切片脫蠟及水化
  干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟,再逐級經純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中,則將切片移至與酒精近似濃度時,即可染色。
  染色
  染色的目的是使細胞組織內的不同結構呈現不同的顏色以便于觀察。未經染色的細胞組織其折光率相似,不易辨認。經染色可顯示細胞內不同的細胞器及內含物以及不同類型的細胞組織。染色劑種類繁多,應根據觀察要求及研究內容采用不同的染色劑及染色方法,還要注意選用適宜的固定劑才能取得滿意的結果。經典的蘇木精(Hematoxylin)和伊紅(曙紅,Eosin)染色法是組織學標本及病理切片標本的常規染色,簡稱HE染色。經HE染色后,細胞核被蘇木精染成紫藍色,多數細胞質及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽離子的染料,染液呈堿性,核內染色質及胞質內核糖體等物質對這種染料有親和性,稱嗜堿性;而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性,對這種染料的親和性,稱嗜酸性。有時不同的組織結構還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示,稱特殊染色。有些細胞組織經硝酸銀浸潤后,可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細胞組織上,呈棕黑色,這種性質稱親銀性,而有些細胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀,還需加還原劑才能將銀離子還原,稱嗜銀性。
  切片脫水、透明和封片
  染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察,需經梯度酒精脫水,在95%及純酒精中的時間可適當加長以保證脫水徹底;如染液為酒精配制,則應縮短在酒精中的時間,以免脫色。二甲苯透明后,迅速擦去材料周圍多余液體,滴加適量(1~2滴)中性樹膠,再將潔凈蓋玻片傾斜放下,以免出現氣泡,封片后即制成永久性玻片標本,在光鏡下可長期反復觀察。注意有些染料需特定廠家生產的產品。根據各種染色方法、組織類別及切片厚度,掌握適宜的染色時間,才能達到較好的染色效果。
  石蠟制片程序及環節繁多,需數日才能完成1個周期,但切片可長期保存,供教學、科研及病理診斷及復察,并可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。病理常規制片過程中已簡化了一些細的環節或縮短了部分處理時間以適應臨床需要(可縮短至2天)。雖然冰凍切片大大快于石蠟切片,但所顯示的形態結構卻不如后者,因此病理醫生最后還需要根據石蠟切片作出準確診斷。近些年來,在病理常規制片過程中采用了微波技術,從而大大縮短了制片過程,而且對形態結構并沒有影響。微波是一種波長很短、頻率卻很高的高頻電磁波[波長為1米 ~1毫米,頻率為300兆赫(MHz)~300千兆赫(GHz)]。組織經微波輻射后加速組織內部分子的高速運動,以使液體的運輸加快,增加彌散、滲透和交換效率,從而加速組織的固定、脫水、透明、包埋和染色各個環節。例如常規福爾馬林固定需數小時~1天,而且能引起組織收縮及某些抗原成分不同程度的受到破壞,微波固定僅需1~2分鐘,且可減少抗原的丟失和損害。選擇適當的檔次(功率)、輻射時間和溫度是極為重要的。目前微波技術的應用在國內尚處于起步階段,許多技術應用環節尚需進一步摸索。
  石蠟切片與其他技術方法的結合
  石蠟切片不僅是經典的方法,又是最基本的方法,它與其他新的技術方法相結合,使傳統的老技術擴大了應用范圍,開辟了許多新領域,增加了許多新的研究、觀察內容。隨新的儀器及新的研究技術的不斷問世及使用,使組織學的觀察研究從簡單的形態結構深入到各種成分的定性觀察,又從定性轉向定量計測,使細胞組織的形態,功能及代謝三結合,從而達到定性可靠、定位準確及定量可測。
毓秀生物科技(上海)有限公司

毓秀生物科技(上海)有限公司

工廠地址:上海市閔行區江月路999號12號樓302室

毓秀生物科技(上海)有限公司版權所有  備案號:滬ICP備19003469號-1  總訪問量:99514  站點地圖  技術支持:化工儀器網  管理登陸

QQ在線客服
聯系方式

18116204803

021-64190080

chinese大众浴室voyeur搓澡1,美女被啪到深处抽搐视频,亚洲处破女 www,脱裤吧精品国产导航