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miRNA熒光定量檢測服務

更新時間:2022-05-10

簡要描述:

miRNA熒光定量檢測服務( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度??捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達量的檢測。

  miRNA熒光定量檢測服務( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR)是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度??捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達量的檢測。

 

miRNA熒光定量檢測服務常有兩種檢測方法

  1)探針法

  PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

 

  2)miRNA熒光定量檢測服務染料嵌入法

  使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結合到雙鏈DNA上面,當體系中的模板被擴增時,熒光染料可以有效結合到新合成的雙鏈上面,隨著PCR的進行,結合的熒光染料越來越多,被儀器檢測到的熒光信號越來越強,從而達到定量的目的。

 

miRNA熒光定量檢測服務
  1)引物設計
  2)RNA提取
  3)RNA逆轉錄合成cDNA
  4)real time PCR 反應

  5)數據分析

 

miRNA熒光定量檢測服務結果
  基因表達量變化的直方圖、熱圖等,miRNA熒光定量檢測服務是功能研究的基礎,鎖定關鍵目標,找到深入研究的方向對研究至關重要。

  是一類長度約19-24nt的非編碼單鏈RNA,通過堿基互補配對的方式與靶基因的3’-UTR區部分或完全互補,剪切靶基因的轉錄產物或者抑制轉錄產物的翻譯,從而起到轉錄后調控靶基因表達的作用。它廣泛存在于動物、植物、真菌及病毒的基因組中,調控生物體生長發育和疾病發生等過程中相關基因的表達。miRNA的異常表達可能會導致生理狀態的異常和疾病的產生,在多種癌癥中,miRNA的表達水平會發生明顯改變,有可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。此外,在許多其他的病變組織和細胞中也檢測到了miRNA的異常表達。因此對miRNA的表達的研究具有重要意義。

  1)樣品提供
  a.RNA樣品:取適量新鮮組織,勻漿后抽提總RNA,并提供RNA質量檢測圖。
  b.組織樣品:取適量(50-100mg)液氮保存的組織。
  c.血液樣品:加凝固劑并離心,取血清、血漿或全血進行分析。
  d.細胞樣品:取107個細胞,吸去培養液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

  提供實驗報告、詳細的實驗方法、實時熒光定量PCR實驗結果、圖表及相關分析數據。

 

miRNA熒光定量檢測服務中的miRNA是如何產生的?

  miRNAs 是轉錄后長片段的 RNA 分子( pri-miRNA )的一部分,首先在細胞核內被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個核苷酸組成的發夾結構 RNA ( pre-miRNA )。這一發夾結構 RNA 運輸到細胞質,被另一個雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切,得到 19-23 個 核苷酸組成的成熟的 miRNA ,結合在與 RNA 介導的沉默復合物( RISC )類似或者相同的復合物中,這個復合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對引導 RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補的堿基配對決定了這個過程的特異性。通過抑制翻譯還是降解發揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯配程度決定的,匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對不完全互補的 mRNA 配對來抑制蛋白質的翻譯過程,因而每個 miRNA 可以有多個靶基因,而幾個 miRNAs 可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個 miRNA 來經濟地調控多個基因的表達,也可以通過幾個 miRNAs 的組合來精細調控某個基因的表達。對于基于 miRNA 調控基因表達的研究的逐步深入,將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調控網絡。

 

miRNA熒光定量檢測服務基本原理

  實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光試劑,利用熒光信號實時檢測PCR進程,zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言,由于其是由21-25個核苷酸組成的小RNA,長度太短,并不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測,但是通過特殊設計的莖環結構的反轉錄引物,配合實時定量PCR引物及探針可以檢測微量樣品中microRNA表達水平,也可以用終點PCR法定性檢測。

 

  雖然 microRNA 實時定量PCR是一種zui近才發展起來的檢測技術,其技術細節還在不斷完善中,但是microRNA 實時定量PCR檢測系統,相對其它microRNA檢測技術有以下優點:
  1.高特異性 , 可以只對成熟 microRNA 進行定量,有效區分成熟 microRNA 分子和前體分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子;
  2.快速,簡單,省時,整個操作只需兩步,不到 3 個小時,即可獲得高質量的數據;
  3.檢測靈敏度高,樣品消耗少,僅需 1-10ng 的總 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ;

  4.超寬的線性范圍,可跨越 7 個數量級;

 

樣品保存及運輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1~2天,2天以后部分組織中的RNA會開始降解。室溫(25℃)穩定保存1周,不會有明顯的RNA降解發生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中,4℃條件下可穩定保存1個月,不會有明顯的RNA降解發生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜,然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去,再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩定保存3~5年。

 

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