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病理組織包埋

更新時間:2021-12-21

簡要描述:

病理組織包埋染色之所以成為細胞染色常用的方法是因為HE染色法過程中除化學反應外,還有物理作用中吸附、吸收效果,使HE染色提供良好的核漿對比染色效果。

  病理組織包埋染色俗稱HE 染色法為蘇木精-伊紅染色法,是石蠟切片技術里常用的染色法之一,也是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中基礎、廣泛的技術方法。


  屬性為堿性的蘇木素染色液可以使細胞著藍色,為酸性的伊紅使細胞著紅色,其結果胞核呈藍色,胞漿呈紅色。兩種不同的染色液使細胞通過顏色來改變折光率,在光鏡下呈現出細胞圖像。


  病理組織包埋染色之所以成為細胞染色常用的方法是因為HE染色法過程中除化學反應外,還有物理作用中吸附、吸收效果,使HE染色提供良好的核漿對比染色效果。


  病理組織包埋染色實驗步驟
  1、樣品制備:對于貼壁生長細胞,胰酶消化,調整細胞濃度約1×105/ml,滴加于蓋玻片上(置于6孔板中),培養相應時間后,取出細胞爬片,用PBS洗滌3次。
  2、樣品固定:95%乙醇固定20min,PBS洗滌2次,每次1min。
  3、染核:蘇木素染液染色2-3min,自來水洗滌。
  4、分色:鏡下觀察,若細胞核染色過深,用1%鹽酸酒精溶液分色數秒,自來水洗滌。
  5、染胞質:浸入伊紅染液染色1min,自來水洗滌。
  6、吹干或自然晾干細胞爬片后,中性樹膠封片。

  若細胞用4%多聚甲醛固定,則染色時間相應延長,蘇木素染色12-15min,伊紅5min即可。


  病理組織包埋染色實驗相關用品
  1、固定液:常用95%乙醇和冰丙酮
  2、蘇木精染液:稱取蘇木精粉0.5g,銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中,然后取NaIO 31g,水5ml,再加入甘油30ml和冰醋酸2ml,混合均勻,濾紙過濾,備用。
  3、伊紅染液:稱取0.5g   伊紅染液,溶于100ml蒸餾水中。
  4、稀鹽酸乙醇溶液:用75%乙醇配制1%鹽酸。
  5、系列濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠。

  6、培養瓶、培養皿、鑷子、蓋玻片、載玻片、顯微鏡。


  病理組織包埋染色實驗結果:
  細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色,軟骨基質、鈣鹽顆粒呈深藍色,粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色,胞漿內嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色,彈力纖維呈亮粉紅色,紅血球呈橘紅色,蛋白性液體呈粉紅色。著況與組織或細胞的種類有關,也隨其生活周期及病理變化而改變。例如,細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿,當其衰老時或發生退行性變則呈現嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現透明變性時,伊紅著色由淺變深。

  病理組織包埋染色常見規格為310ml和3100lm。


  一、常規病理組織包埋染色/HE染色步驟
  1、石蠟切片脫蠟復水:
  (1)二甲苯(Ⅰ) 15min
  (2) 二甲苯(Ⅱ) 15 min
  (3)二甲苯:無水乙醇=1:1 2min
  (4) 100%乙醇(Ⅰ) 5min
  (5) 100%乙醇(Ⅱ) 5 min
  (6) 80%乙醇 5min
  (7) 蒸餾水 5 min

 

     2、蘇木精溶液染色:

  (1) 蘇木精溶液染色 5 min
  (2) 水洗10 min 或流水沖洗5 min返藍
  (3) 1%鹽酸乙醇 30s分化
  (4) 水洗 30 s

  (5)蒸餾水過洗 5 s 


  3、伊紅液染色
  (1) 0.5%伊紅液染色 1-3 min

  (2) 蒸餾水稍洗 30 s


  4、病理組織包埋染色脫水封片
  (1) 80%乙醇稍洗 30 s
  (2) 95%乙醇(Ⅰ)1 min
  (3) 95%乙醇(Ⅱ) 1 min
  (4) 無水乙醇 (Ⅰ)3 min
  (5)無水乙醇(Ⅱ)3 min
  (6)二甲苯(Ⅰ) 3 min
  (7)二甲苯(Ⅱ) 3 min

  (8)中性樹膠封固


  二、病理組織包埋染色/HE染色結果的判斷
  1、實驗結果
  細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色,軟骨基質、鈣鹽顆粒呈深藍色,粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色,胞漿內嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色,彈力纖維呈亮粉紅色,紅血球呈橘紅色,蛋白性液體呈粉紅色。

  著色深淺與組織或細胞的種類有關,也隨其生活周期及病理變化而改變。例如,細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜堿,當其衰老時或發生退行性變則呈現嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現透明變性時,伊紅著色由淺變深。


  2、病理組織包埋染色/HE染色評定標準:
 ?。?)切片完整,厚度4-6微米,厚薄均勻,無皺褶無刀痕;
 ?。?)染色核漿分明,紅藍適度,透明潔凈,封裱美觀。

  

病理組織包埋染色全組織包埋免疫熒光染色

  (一)取材及組織處理

  另取5只小鼠經水合氯醛麻醉后,建立跨區耳瓣模型,方法同前。在建模后第3天處死小鼠,脫毛液盡量去除小鼠耳部毛發,將耳瓣側耳部剪下,利用生理鹽水洗凈,在光學放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子進一步去除毛發。接著按照以下步驟進行組織處理:(1)將剪下的小鼠耳放入裝有甲醇的EP管中,沉至管底,-20 ℃保存至少30 min;(2)取出鼠耳,放入裝有Hanks平衡鹽液的培養皿中,在體式顯微鏡下利用鑷子緩慢分離,將耳組織分為前層皮膚、軟骨及后層皮膚,將分離出的前層皮膚放入裝有4%的多聚甲醛的EP管中,4 ℃固定1 h直至組織沉淀至管底;(3)取出前層皮膚,放入1×PBS中洗滌3次,每次5 min;(4)取出洗滌后的前層皮膚,置于裝有1×PBS緩沖液的培養皿中,在光學放大體式顯微鏡下使用剪刀和鑷子剔除多余的脂肪結締組織,進行精修。


  (二)全組織包埋免疫熒光染色

  對建立跨區耳瓣模型第3 d的鼠耳進行全組織包埋免疫熒光染色,觀察跨區耳瓣模型建立3 d后,跨區耳瓣choke區域小血管及毛細血管的管徑大小,末梢神經走行以及與血管再生相關的單核巨噬細胞[4]分布情況。CD31與α-SMA抗體分別對血管內皮與血管平滑肌進行染色,利用Tuj1及α-SMA對軸突與血管分別進行標志,利用CD68抗體進行單核巨噬細胞染色。具體操作步驟如下:(1)制備封閉液(簡稱10%HIGS),將10 ml山羊血清、0.2 ml曲拉通X-100溶于100 ml磷酸鹽緩沖液中,并應用0.45 μm的濾器對配成的溶液進行濾過。(2)在室溫條件下,將處理完的鼠耳前層皮膚放入裝有1 ml 10% HISG的24孔板中,搖床輔助孵育30 min。(3)制備一抗溶液,使用10%HIGS稀釋一抗,稀釋比例1∶500。將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1一抗同時稀釋混合使用,孵育時間較長時可加入0.2%抑菌防腐。(4)將經孵育的皮膚取出放入新孔或用滴管吸除10%HIGS溶液后,加入150 μm一抗溶液,4 ℃搖床孵育過夜,第2天將皮膚轉移至新孔洞或用滴管吸除原有溶液,加入1 ml 2%HIGS溶液,室溫下搖床洗脫一抗3次,每次15 min,每次洗脫更換液體。(5)制備二抗溶液,使用10%HIGS稀釋二抗,稀釋比例1∶500,將CD31、CD68、α-SMA、Tuj1二抗同時稀釋混合使用,通過0.22 μm的生物濾膜對配成的液體進行過濾。13 000 g離心二抗溶液,離心5 min。(6)將洗脫后的皮膚取出,放入新孔洞或用滴管吸除原有溶液,加入150 μm二抗溶液,室溫下搖床孵育1 h,避光。(7)取出皮膚,將皮膚轉移至新孔洞,加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下,搖床洗脫二抗3次,每次15 min,每次洗脫更換液體。(8)取出皮膚,轉移至新孔洞,加入150 μm DAPI (1∶1000) 溶液染色,孵育10 min。(9)取出皮膚,轉移至新孔洞,加入1 ml 2%HIGS溶液。室溫下,搖床洗脫3次,每次15 min,每次洗脫更換液體。(10)把組織樣本放入載玻片上鋪平,滴加1滴熒光封片劑,封蓋蓋玻片,放于室溫過夜,待熒光封片劑凝固,于共聚焦激光顯微鏡下掃描觀察。




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